Dna (Gen) Klonlaması Nedir?

Deoksiribonükleik asit (DNA) sentezi, nükleik asit iplikçiklerinin kopyalarının yapıldığı bir işlemdir. Doğada, DNA sentezi hücrelerde DNA replikasyonu olarak bilinen bir mekanizma ile gerçekleşir. Genetik mühendisliği ve enzim kimyasını kullanan bilim insanları, DNA sentezlemek için insan yapımı yöntemler geliştirdiler.

Bunlardan en önemlisi poli-meraz zincir reaksiyonudur (PCR). İlk olarak 1980'lerin başında geliştirilen PCR, orijinal patentin 300 milyon dolara satıldığı multi milyar dolarlık bir endüstri haline geldi.

Tarih

DNA, 1951'de Francis Crick, James Watson ve Maurice Wilkins tarafından keşfedildi. Rosalind Franklin, Watson ve Crick tarafından üretilen x-ışını kristalografi verilerini kullanarak, DNA'nın yapısının bir çift sarmal olduğu tespit edildi. Bu çalışma için Watson, Crick ve Wilkins 1962'de Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'nü aldılar . Yıllar boyunca bilim adamları, “yaşam kodunu” bulmaya çalışan DNA ile çalıştılar.

DNA'nın protein dizileri için talimat kodu olarak hizmet ettiğini buldular. Ayrıca her organizmanın benzersiz bir DNA sekansına sahip olduğunu ve tarama, teşhis ve tanımlama amacıyla kullanılabileceğini buldular. Bu çalışmalarda sınırlayıcı olan bir şey, tek bir kaynaktan elde edilebilen DNA miktarıdır.

DNA'nın doğası belirlendikten sonra, bilim adamları hücresel genlerin bileşimini inceleyebildiler. Bir gen, bir proteinin inşası için kod sağlayan DNA baz çiftlerinin spesifik bir dizisidir. Bu proteinler göz rengi veya kan grubu gibi bir organizmanın özelliklerini belirler. Belirli bir gen izole edildiğinde, o molekülün kopyalarının sentezlenmesi arzu edilir hale geldi. Çok miktarda spesifik DNA'nın sentezlenmesinin ilk yollarından biri genetik mühendisliğiydi.

Genetik mühendisliği, ilgilenilen bir geni bakteriyel plazmid ile birleştirerek başlar. Bir plazmid, birçok bakteride bulunan küçük bir DNA dizisidir. Ortaya çıkan hibrit DNA'ya rekombinant DNA denir. Bu yeni rekombinant DNA plazmidi daha sonra bakteri hücrelerine enjekte edilir.

Hücreler daha sonra bir kültürde büyümesine ve çoğalmasına izin verilerek klonlanır. Hücreler çoğaldıkça eklenen genin kopyaları da çoğalır. Bakteriler yeterince çoğaldığında, sokulan genin çoklu kopyaları izole edilebilir. Bu DNA sentezi yöntemi, birkaç hafta içinde bir genin milyarlarca kopyasını üretebilir.

1983 yılında, Kary Mullis polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) adı verilen DNA'yı sentezlemek için bir işlem geliştirdiğinde DNA kopyaları üretmek için gereken süre önemli ölçüde azaldı . Bu yöntem, birkaç saat içinde milyarlarca DNA dizisi kopyası üreten bilinen yöntemlerden çok daha hızlıdır.

DNA polimeraz, nükleotidler ve primerler içeren bir çözeltiye, çift sarmallı DNA'nın küçük bir bölümünü koymakla başlar. Çözelti, DNA zincirlerini ayırmak için ısıtılır. Soğutulduğunda, polimeraz her bir ipliğin bir kopyasını oluşturur. İşlem, istenen miktarda DNA üretilene kadar her beş dakikada bir tekrarlanır.

1993 yılında Mullis'in PCR geliştirmesi ona Nobel Kimya Ödülü kazandırdı. Günümüzde PCR, tıbbi teşhis, adli tıp ve mikrobiyoloji alanlarında devrim yaratmıştır. Genetik araştırmadaki en önemli gelişmelerden biri olduğu söyleniyor.

Arka Plan

DNA sentezini anlamanın anahtarı yapısını anlamaktır. DNA, nükleotitler adı verilen kimyasal birimlerden oluşan uzun zincirli bir polimerdir. Genetik materyal olarak da bilinen DNA, çoğu canlı organizmada protein sentezini dikte eden bilgileri taşıyan moleküldür.

Tipik olarak DNA, kimyasal olarak bağlı nükleotitlerin iki zinciri olarak bulunur. Bu bağlantılar, temel eşleme kuralları tarafından belirlenen belirli kalıpları takip eder. Her nükleotit, bir deoksiriboz şeker molekülü, bir fosfat grubu ve azot içeren dört bazdan birinden oluşur.

Bazlar arasında pirimidin timin (T) ve sitozin (C) ve pürinler adenin (A) ve guanin (G) bulunur. DNA'da adenin genellikle timine ve guanine sitozinle bağlanır. Molekül, bükülmüş bir merdiveni veya spiral merdiveni görüntüleyerek hayal edilebilen çift sarmal olarak adlandırılan bir yapıda düzenlenmiştir. Bazlar merdivenin basamaklarını oluştururken, şeker ve fosfat kısımları merdivenin kenarlarını oluşturur. Sekans olarak adlandırılan nükleotitlerin bağlanma sırası, DNA sekanslaması olarak bilinen bir işlemle belirlenir.

Hammadde

DNA sentezi için kullanılan birincil hammaddeler arasında DNA başlangıç materyalleri, taq DNA polimeraz, primerler, nükleotitler ve tampon çözeltisi bulunur. Bunların her biri milyonlarca DNA molekülünün üretiminde önemli bir rol oynamaktadır.

Kontrollü DNA sentezi, kopyalanacak küçük bir DNA segmentinin tanımlanmasıyla başlar. Bu tipik olarak istenen bir proteinin kodunu içeren spesifik bir DNA dizisidir. Şablon DNA olarak adlandırılan bu malzemeye, yaklaşık 0.1-1 mikro gramlık konsantrasyonlarda ihtiyaç duyulur.

DNA saflaştırmasında kullanılan bileşiklerin eser miktarları bile PCR işlemini engelleyebileceğinden yüksek derecede saflaştırılmalıdır. Bir DNA zincirini saflaştırmanın bir yöntemi, onu% 70 etanol ile işlemektir.

DNA replikasyon işlemi 1980'den önce bilinmesine rağmen, bilinen ısıya dayanıklı DNA polimerazları olmadığından PCR mümkün değildi. DNA polimeraz, DNA sentezinde yer alan reaksiyonları katalize eden enzimdir.

1980'lerin başında, bilim insanları Gayzer deliklerinin etrafında yaşayan bakteriler buldular. Thermus aquaticus adı verilen bu organizmaların, aşırı ısı seviyelerinde stabil ve fonksiyonel bir DNA polimeraz olduğu ortaya çıktı. Bu taq DNA polimeraz, modern DNA sentez tekniklerinin temel taşı oldu.

Tipik bir PCR işlemi sırasında 2-3 mikrogram taq DNA polimeraz gereklidir. Bununla birlikte, çok fazla kullanılırsa, istenmeyen, spesifik olmayan DNA dizileri ortaya çıkabilir.

Polimeraz, her DNA dizisi üzerinde karşılık gelen nükleotitleri birleştirerek DNA dizilerini oluşturur. Kimyasal olarak konuşursak, nükleotidler bir şeker yapısı, bir fosfat grubu ve bir siklik baz dahil üç tip moleküler gruptan oluşur. Şeker kısmı, tüm nükleotitler için birincil yapı sağlar.

Genel olarak şekerler, bir dizi hidroksi (-OH) grubu eklenmiş beş karbon atomundan oluşur. DNA için şeker 2-deoksi-D-ribozdur. Bir nükleotidin tanımlayıcı kısmı, şekere kovalent olarak bağlanan hetero-siklik bazdır. Bu bazlar ya pirimidin ya da pürin gruplarıdır ve nükleik asit kodunun temelini oluştururlar. Adenin ve guanin dahil olmak üzere iki tip pürin bazı bulunur. DNA'da, timin ve sitosin olmak üzere iki tip pirimidin bazı bulunur. Bir fosfat grubu, bir nükleotidin son kısmını oluşturur. Bu grup,fosforik asit içerir ve beşinci karbon üzerindeki şeker yapısına kovalent olarak bağlanır.

Üretim Süreci

DNA sentezi laboratuvarlarda tipik olarak küçük bir ölçekte yapılır. Numune hazırlama, DNA sentezi reaksiyon döngüsü ve DNA izolasyonu olmak üzere üç farklı süreç içerir. Bu üretim adımları, kontaminasyonu önlemek için tipik olarak ayrı alanlarda yapılır. Bu prosedürleri takiben bilim insanları birkaç DNA dizisini milyonlarca ve milyonlarca tam kopyaya dönüştürebilirler.

Numunelerin Hazırlanması

1 DNA sentezine başlamak için çeşitli çözeltiler hazırlanır. Bu genellikle kontaminasyonu en aza indirmek için bir UV lambası ile donatılmış bir laminer akış kabininde yapılır. Bilim insanları her üretim aşamasında benzer nedenlerle taze eldivenler kullanıyorlar. Tipik olarak, primerler, polimerazlar ve dNTP'ler dışındaki tüm başlangıç çözeltileri, herhangi bir kirletici organizmayı öldürmek için bir otoklav içine konur. İki ayrı çözüm yapılır. Bir tanesi tamponu, primerleri ve polimerazı içerir. Diğeri MgCl2 ve şablon DNA içerir. Bu çözeltilerin tümü reaksiyona başlamak için küçük tüplere konur.

DNA Sentez Döngüsü

Tepkime çözeltileri hazırlandıktan sonra PCR döngüsü başlatılır. İlk aşama DNA'nın denatürasyonunu içerir. En önemli başlangıç adımlarından biri DNA şablonunun tamamen denatürasyonudur. DNA'nın denatürasyonu esasen çift bağlı ipin parçalanması anlamına gelir. DNA molekülünün bu "açılması", üretilecek bir sonraki DNA molekülü için şablon sağlar. Eksik bir denatürasyon, ilk döngüde sonraki her döngüyü olumsuz etkileyen etkisiz bir kopya ile sonuçlanacaktır. İlk denatürasyon DNA şablonu çözeltisinin bir ila üç dakika boyunca 95 ° C'ye ısıtılmasıyla yapılır. Toplam süre, şablon bileşimine bağlıdır. Tekrar döngülerinde, denatürasyon adımı yaklaşık iki dakika sürer ve çözeltinin 94 ° C'ye (201PF) ısıtılmasını içerir.
DNA ayrı şeritlere ayrıldığında, sıcaklık 50-65 ° C'ye (122-149 ° F) düşürülür. Bu, astar tavlama adımı olarak bilinir ve yaklaşık iki dakika sürer. Bu noktada, sol ve sağ primerler, DNA şablonundaki tamamlayıcı bazları ile eşleşir ve kimyasal olarak bağlanır.
Bir sonraki aşama, genişletme aşamasını içerir. Reaksiyonun bu kısmı DNA dizisinin çoğunun kopyalandığı zamandır. Sistemin sıcaklığı 72 ° C'ye (162 ° F) ısıtılır ve kopyalanacak DNA'nın uzunluğuna bağlı olarak orada tutulur. Bu aşamada, DNA polimeraz ipliklerle etkileşir ve tüm uzunluk boyunca tamamlayıcı nükleotitler ekler. Bu aşamada gereken süre her 1000 baz çifti için yaklaşık bir dakikadır.
Bu birinci döngüden sonra, DNA sentez döngüsü tekrarlanır. Döngü sayısı, başlangıçtaki DNA miktarına ve istenen DNA miktarına bağlıdır. Şablon DNA'nın 10'dan az kopyası mevcutsa, 40 döngü gereklidir. Daha fazla başlangıç DNA'sında 25-30 döngü yeterlidir.
Son döngü sırasında, numune yaklaşık 15 dakika boyunca 72 ° C sıcaklıkta tutulur. Bu, yeni bir DNA şeridinin herhangi bir çıkıntı yapan ucunun doldurulmasına (nükleotidlerle) izin verir. Bu aşamada, polimeraz, DNA zincirlerinin bir ucuna fazladan A nükleotitler ekler.

DNA İzolasyonu

Reaksiyonlar tamamlandığında, DNA, DNA polimeraz, MgCI2 ve primerler gibi PCR reaksiyona giren malzemelerden izole edilir. Bu, fenol, EDTA ve Proteinaz K gibi bileşikler ilave edilerek yapılır. Santrifüjleme de bu konuda yardımcı olur.

Gelecek

Bilim adamları DNA sentezi için düzenli olarak PCR kullanırken, DNA replikasyonu hakkında hala anlaşılmamış çok şey var. Gelecekte, araştırma, sürecin ilgili bileşenler ve ara maddeler gibi birkaç önemli adımının ayrıntılarını açıklığa kavuşturulmalıdır. Ek olarak, daha küçük başlangıç örneklerinden daha fazla DNA oluşturulmasını mümkün kılan geliştirilmiş polimerazlar geliştirilebilir. Bir gün DNA sentezinin, canlı organizmaların bazı önemli yönlerinin kilidini açmasına yardımcı olacağı ve çeşitli kanserleri, viral ve bakteriyel enfeksiyonları tedavi edecek geliştirme ilaçlarına yol açacağı umulmaktadır.